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近年來(lái)，酶標(biāo)儀的功能逐漸增多，應(yīng)用領(lǐng)域也不斷得到拓展。其中常見(jiàn)的多功能酶標(biāo)儀為具有光吸收（ABS），熒光強(qiáng)度（FL）和化學(xué)發(fā)光（LUM）基礎(chǔ)三功能酶標(biāo)儀，光吸收主要用于檢測(cè)OD值，包括Elisa，酶活，酶動(dòng)力學(xué)，OD600等，熒光與化學(xué)發(fā)光則檢測(cè)的是熒光強(qiáng)度。

那熒光與化學(xué)發(fā)光有什么區(qū)別呢，什么實(shí)驗(yàn)該用熒光檢測(cè)，什么又該用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)呢？

首先，熒光是被激發(fā)后，酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度，例如，熒光染料Hoechst，PI，Calcien AM等以及熒光報(bào)告基因GFP，RFP等；化學(xué)發(fā)光是指通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)出的可見(jiàn)光，與熒光相比不需要激發(fā)光，所以具有更低的背景。

熒光原理：熒光是短波長(zhǎng)的光激發(fā)，電子從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，電子需要重新回到基態(tài)，這時(shí)損失的一部分能量，會(huì)以熒光的形式呈現(xiàn)。

熒光檢測(cè)原理

化學(xué)發(fā)光原理：按原理可以分為兩類(lèi)，其中一類(lèi)為化學(xué)反應(yīng)發(fā)光，常見(jiàn)是魯米諾的反應(yīng)發(fā)光，另外一類(lèi)為生物化學(xué)發(fā)光，例如螢火蟲(chóng)熒光素酶，海腎熒光素酶。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)原理

下面我們來(lái)看一下熒光與化學(xué)發(fā)光都有哪些應(yīng)用？

一. 熒光

1. 細(xì)胞活力，毒性檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)原理：熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)成正比、靈敏度高、特異性好、組合成復(fù)合熒光染料使用。例如：根據(jù)細(xì)胞膜完整性差異，熒光染料（Calcein AM，EthD-III）對(duì)活細(xì)胞/死細(xì)胞的穿透特性不同，對(duì)其進(jìn)行特異性標(biāo)記，有常規(guī)熒光染料也有優(yōu)化試劑盒。

2. 活細(xì)胞中熒光蛋白的表達(dá)

熒光蛋白在監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)研究中，起到越來(lái)越重要的作用，隨著時(shí)間的推移，目前可以使用的熒光蛋白的種類(lèi)也越來(lái)越豐富。他們都可以在眾多細(xì)胞和組織中被克隆復(fù)制，穩(wěn)定且毒性小，不需額外輔助也可在體內(nèi)產(chǎn)生熒光。

例如：GFP報(bào)告基因是一種同時(shí)編碼GFP和靶標(biāo)序列的基因， 把GFP的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)GFP的熒光強(qiáng)弱來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控

二．化學(xué)發(fā)光

1.  雙熒光素酶報(bào)告基因

報(bào)告基因一般用來(lái)研究真核生物的基因表達(dá)，在雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，細(xì)胞需轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒，一種含有目的基因調(diào)控的啟動(dòng)子，另一種包含一個(gè)質(zhì)控基因的組成型啟動(dòng)子，將兩個(gè)報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染，可以更好的減小實(shí)驗(yàn)誤差。

Promega的雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（DLR）允許使用者在一個(gè)微孔板中分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶，其中螢火蟲(chóng)作為報(bào)告基因，海腎作為質(zhì)控基因，分別進(jìn)行兩次化學(xué)發(fā)光讀數(shù)。

2. 魯米諾試劑—化學(xué)發(fā)光

ELISA化學(xué)發(fā)光夾心法試劑盒QuantiGlo luminescent ELISA (R&D Systems) ，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生熒光，可以用來(lái)檢測(cè)人類(lèi)VEGF，內(nèi)皮素-1，IL-6，IL-8，IL-1，IL-2，TNF-alpha等。